Prestazione di quattru testi di amplificazione di l'acidi nucleichi per identificà u SARS-CoV-2 in Etiopia

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Dapoi l'epidemia di a malatia di u coronavirus (COVID-19) di u 2019, parechji testi cummerciali di amplificazione di l'acidi nucleichi (NAAT) sò stati sviluppati in u mondu sanu è sò diventati testi standard. Ancu s'è parechji testi sò stati sviluppati rapidamente è applicati à i testi diagnostichi di laburatoriu, a prestazione di sti testi ùn hè stata valutata in una varietà di cuntesti. Dunque, questu studiu hà avutu cum'è scopu di valutà a prestazione di i testi Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI è Sansure Biotech utilizendu u Standard di Riferimentu Cumpostu (CRS). U studiu hè statu realizatu à l'Istitutu Etiope di Salute Pubblica (EPHI) da u 1u à u 30 di dicembre di u 2020. 164 campioni nasofaringei sò stati estratti utilizendu u mini kit QIAamp RNA è u sistema di preparazione di campioni di DNA Abbott. Di 164 campioni, u 59,1% era pusitivu è u 40,9% era negativu per CRS. A pusitività di Sansure Biotech era significativamente bassa paragunata à CRS (p < 0,05). A pusitività di Sansure Biotech era significativamente bassa paragunata à CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). I risultati pusitivi di Sansure Biotech eranu significativamente più bassi paragunati à CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）。 У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech hà avutu significativamente menu risultati pusitivi paragunatu à CRS (p < 0,05).L'accordu generale di e quattru analisi era di 96,3-100% paragunatu à CRS. In più di u bassu tassu di pusitività di u test Sansure Biotech, a prestazione di i quattru test era guasi paragunabile. Cusì, u test Sansure Biotech [Research Only (RUO)] richiede una validazione supplementaria per u so usu in Etiopia. Infine, si deve cunsiderà una ricerca supplementaria per valutà i test cù l'affermazioni di u fabricatore apprupriate.
L'analisi di laburatoriu face parte di u Pianu Strategicu di l'Organizazione Mondiale di a Salute (OMS) per a Preparazione è a Risposta à a Malattia di Coronavirus 2019 (COVID-19) (SPRP). L'OMS cunsiglia chì i paesi anu bisognu di custruisce a capacità di laburatoriu per migliurà a preparazione, a gestione adatta di i casi, a vigilanza è a risposta rapida à e sfide di salute publica. Questu suggerisce chì u rolu di u laburatoriu hè chjave per caratterizà a malatia è l'epidemiologia di l'agenti infettivi emergenti è cuntrullà a so diffusione.
A diagnosi di COVID-19 richiede informazioni epidemiologiche è mediche, sintomi/segni persunali, è dati radiografici è di laburatoriu2. Dapoi chì l'epidemia di COVID-19 hè stata signalata in Wuhan, Cina, parechji testi cummerciali di amplificazione di l'acidi nucleici (NAAT) sò stati sviluppati in u mondu sanu. A reazione à catena di a polimerasi à trascrizione inversa in tempu reale (rRT-PCR) hè stata aduprata cum'è metudu di rutina è standard per a diagnosi di laburatoriu di l'infezzione da sindrome respiratoria acuta severa 2 (SARS-CoV-2)3. A rilevazione moleculare di SARS-CoV-2 hè tipicamente basata nantu à i geni N (gene di a proteina nucleocapsidica), E (gene di a proteina di l'involucru) è RdRp (gene di a RNA polimerasi dipendente da RNA) in a regione ORF1a/b (gene di lettura aperta 1a/b) identificata da u genomu virale. Sò cunsiderate cum'è e principali regioni cunservate truvate in i genomi virali per u ricunniscenza di u virus4. Trà questi geni, i geni RdRp è E anu una alta sensibilità di rilevazione analitica, mentre chì u genu N hà una bassa sensibilità analitica5.
A prestazione di i testi PCR pò varià secondu diversi fattori cum'è: reagenti d'estrazione, reagenti d'amplificazione/rilevazione, metudu d'estrazione, qualità di a macchina PCR è altri strumenti. À partesi da aprile 2020, più di 48 dispositivi diagnostichi diversi da nove paesi anu ricevutu l'Autorizazione d'Usu d'Emergenza (EUA) per a diagnostica COVID-196. In Etiopia, più di 14 piattaforme PCR in tempu reale sò aduprate per a rilevazione PCR di SARS-CoV-2 in 26 istituzioni sanitarie publiche, cumprese ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 è Quant-studio7. Inoltre, sò dispunibili diversi kit di test PCR, cum'è u test Daan Gene, u test Abbott SARS-CoV-2, u test Sansure Biotech è u test SARS-CoV-2 BGI. Ancu s'è a rRT-PCR hè assai sensibile, alcuni pazienti cun COVID-19 segnalanu risultati falsi negativi per via di copie insufficienti di acidu ribonucleicu (RNA) virale in i campioni per via di una raccolta, un trasportu, un almacenamentu è una manipulazione impropri, è testi di laburatoriu. cundizioni è azzioni di u persunale8. Inoltre, a mala manipulazione di campioni o cuntrolli, l'impostazione di a soglia di u ciclu (Ct) è a reattività incruciata cù altri acidi nucleici patogeni o RNA SARS-CoV-2 inattivi/residuali ponu purtà à risultati falsi pusitivi in ​​i testi rRT-PCR9. Cusì, hè chjaru chì i testi PCR ponu effettivamente identificà i purtatori di frammenti di geni, postu chì ùn ponu mancu distingue trà geni virali veramente attivi, dunque i testi ponu solu identificà i purtatori è micca i pazienti10. Dunque, hè impurtante valutà e prestazioni diagnostiche utilizendu metudi standard in u nostru ambiente. Ancu s'è parechji reagenti NAAT sò dispunibili à l'Istitutu Etiope di Salute Pubblica (EPHI) è in tuttu u paese, ùn hè stata ancu riportata alcuna valutazione comparativa di a so efficacia. Dunque, questu studiu hà avutu cum'è scopu di valutà e prestazioni comparative di i kit dispunibili cummercialmente per a rilevazione di SARS-CoV-2 per rRT-PCR utilizendu campioni clinichi.
Un totale di 164 participanti cun suspettu COVID-19 sò stati inclusi in questu studiu. A maiò parte di i campioni eranu da centri di trattamentu (118/164 = 72%), mentre chì i restanti 46 (28%) participanti eranu da centri senza trattamentu. Frà i participanti micca trattati à u centru, 15 (9,1%) avianu casi clinicamente suspettati è 31 (18,9%) avianu cuntatti di casi cunfirmati. Novantatrè (56,7%) participanti eranu masci, è l'età media (± SD) di i participanti era di 31,10 (± 11,82) anni.
In questu studiu, sò stati determinati i tassi pusitivi è negativi di quattru testi per COVID-19. Cusì, i tassi pusitivi di u test Abbott SARS-CoV-2, u test Daan Gene 2019-nCoV, u test SARS-CoV-2 BGI è u test Sansure Biotech 2019-nCoV eranu rispettivamente 59,1%, 58,5%, 57,9% è 55,5%. I punteggi di u standard di riferimentu cumpostu (CRS) pusitivi è negativi eranu rispettivamente 97 (59,1%) è 67 (40,9%) (Tabella 1). In questu studiu, a definizione di CRS era basata annantu à a regula "qualsiasi pusitivu", per a quale, trà quattru risultati di test, dui o più risultati di test chì anu datu u listessu risultatu sò stati cunsiderati veri pusitivi o negativi.
In questu studiu, avemu trovu una percentuale di accordu negativu (NPA) di 100% (95% CI 94,6-100) per tutte l'analisi paragunate à CRS. L'analisi di Sansure Biotechnology hà mostratu un PPA minimu di 93,8% (95% CI 87,2-97,1) è l'analisi di Daan Gene 2019-nCoV hà avutu un accordu generale di 99,4% (95% CI 96,6-99,9). In cuntrastu, l'accordu generale trà u test SARS-CoV-2 BGI è u test Sansure Biotech 2019-nCoV era di 98,8% è 96,3%, rispettivamente (Tabella 2).
U cuefficiente di accordu kappa di Cohen trà i risultati di u test CRS è Abbott SARS-CoV-2 era cumpletamente coerente (K = 1,00). In listessu modu, i valori kappa di Cohen rilevati da Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI è Sansure Biotech 2019-nCoV sò ancu cumpletamente coerenti cù CRS (K ≥ 0,925). In questa analisi comparativa, u test chi-quadratu (test McNemar) hà dimustratu chì i risultati di u test Sansure Biotech 2019-nCoV eranu significativamente diversi da i risultati CRS (p = 0,031) (Tabella 2).
Cum'è mostratu in Fig.1 a percentuale di u valore Ct u più bassu (< 20 Ct) di u test Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp è N cumminati) era 87,6% è u valore Ct di u genu ORF1a/b di u test Sansure Biotech 2019-nCoV hà dimustratu chì a percentuale di u valore Ct bassu (< 20 Ct) era 50,3% è u valore Ct altu (36-40 Ct) era 3,2%. 1 a percentuale di u valore Ct u più bassu (< 20 Ct) di u test Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp è N cumminati) era 87,6% è u valore Ct di u genu ORF1a/b di u test Sansure Biotech 2019-nCoV hà dimustratu chì a percentuale di u valore Ct bassu (< 20 Ct) era 50,3% è u valore Ct altu (36-40 Ct) era 3,2%.Cum'è mostratu in Fig.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N, 6%,со и N) значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 2019-nCoV) вя, 20% а высокое значение Ct (36-40 Ct) составляло 3,2%. 1, a percentuale di l'analisi di u valore Ct u più bassu (< 20 Ct) di Abbott SARS-CoV-2 (gene cumminatu RdRp è N) era 87,6%, è u valore Ct di l'analisi di u genu ORF1a/b di Sansure Biotech 2019-nCoV hà dimustratu chì a percentuale di valore Ct bassu (< 20 Ct) rapprisentava u 50,3%, è u Ct di valore altu (36-40 Ct) rapprisentava u 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20%，San Biotech，876. 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，4高Ct 值(36)–4高Ct 值(36)的百分比为3.2%。 Cum'è mostratu in a Figura 1, a percentuale di valore Ct più bassa (< 20 Ct) di u test Abbott SARS-CoV-2 (cumminazione di u genu RdRp è N) hè 87,6%, u valore Ct di u genu ORF1a/b di u test Sansure Biotech 2019-nCoV mostra una percentuale bassa di Ct (< 20 Ct) di 50,3%, a percentuale di Ct (36-40 Ct) hè 3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое низкое на праза Ct (< 20 Ct) в размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV покализ nCoV покат. Cum'è mostratu in a Figura 1, u test Abbott SARS-CoV-2 (cumbinendu i geni RdRp è N) hà avutu u valore Ct percentuale più bassu (< 20 Ct) à 87,6%, mentre chì u valore Ct di u genu ORF1a/b in u studiu Sansure Biotech 2019 - L'analisi di nCoV hà mostratu un Ct bassu. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких значений Ct (36-40 Ct) составил составил 2%. A percentuale di valori (< 20 Ct) era di 50,3%, è a percentuale di valori Ct elevati (36-40 Ct) era di 3,2%.U test Abbott SARS-CoV-2 B hà registratu valori Ct superiori à 30. Da l'altra parte, in u test BGI SARS-CoV-2, u genu ORF1a/b avia un valore Ct altu (> 36 Ct), a percentuale era di 4% (Fig. 1). Da l'altra parte, in u test BGI SARS-CoV-2, u genu ORF1a/b avia un valore Ct altu (> 36 Ct), a percentuale era di 4% (Fig. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент ковот 4% (рис. 1). Da l'altra parte, in l'analisi di BGI, u genu SARS-CoV-2 ORF1a/b avia un valore Ct altu (> 36 Ct), a percentuale di u quale era di 4% (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比（分比一4% Da l'altra parte, in a detezione BGI SARS-CoV-2, a percentuale di u genu ORF1a/b cù un valore Ct altu (>36 Ct) hè di 4% (Figura 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) со. 4% (висо. 4%). Da l’altra parte, in l’analisi BGI SARS-CoV-2, a percentuale di geni ORF1a/b cù valori Ct elevati (>36 Ct) era di 4% (Fig. 1).
In questu studiu, avemu pigliatu 164 campioni nasofaringei. Per tutti i tipi di analisi, l'isolamentu è l'amplificazione di l'ARN sò stati realizati utilizendu i metudi è i kit raccomandati da i rispettivi pruduttori.
Stu studiu hà dimustratu chì u test d'Abbott per u SARS-CoV-2 hà a listessa prestazione di rilevazione cum'è u CRS, cù una concordanza di 100% pusitiva, negativa è generale. L'accordu kappa di Cohen hè 1,00, chì indica un accordu cumpletu cù u CRS. Un studiu simile di l'Università di Washington in i Stati Uniti hà trovu chì a sensibilità è a specificità generale di u test d'Abbott per u SARS-CoV-2 era di 93% è 100%, rispettivamente, paragunatu à u test determinatu in laburatoriu (LDA) di i CDC. 11. U sistema di rilevazione Abbott SARS-CoV-2 hè basatu annantu à a rilevazione cumminata simultanea di i geni N è RdRp, postu chì i dui geni sò più sensibili, minimizendu i falsi negativi12. Un studiu in Vienna, Austria, hà ancu dimustratu chì i grandi volumi di campioni d'estrazione è i volumi di eluente di rilevazione anu minimizatu l'effetti di diluizione è aumentatu l'efficienza di rilevazione13. Cusì, a cumpatibilità perfetta di Abbott per u test SARS-CoV-2 pò esse assuciata cù un sistema di rilevazione di piattaforma chì rileva simultaneamente i geni combinatori, estrae un gran numeru di campioni (0,5 ml) è usa una grande quantità di eluente (40 µl).
I nostri risultati anu ancu dimustratu chì a prestazione di rilevazione di u test geneticu Daan era guasi a stessa di quella di CRS. Questu hè coerente cù un studiu14 realizatu à l'Università di Anhui in Huainan, Cina, è l'affermazione di u fabricatore di un accordu pusitivu à 100%. Malgradu i rapporti di risultati coerenti, un campione era falsu negativu dopu avè ritestu u listessu eluatu, ma era pusitivu in i test Abbott SARS-CoV-2 è Sansure Biotech nCoV-2019. Questu suggerisce chì ci pò esse variabilità in i risultati trà diversi tipi di test. Eppuru, in u studiu realizatu in Cina15, u risultatu di u test di u Gene Daan era significativamente differente (p < 0,05) paragunatu à u so test di riferimentu definitu in laburatoriu. Eppuru, in u studiu realizatu in Cina15, u risultatu di u test di u Gene Daan era significativamente differente (p < 0,05) paragunatu à u so test di riferimentu definitu in laburatoriu. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значитенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значитенном () значитенном (5) их лабораторного эталонного анализа. Tuttavia, in un studiu in Cina15, u risultatu di l'analisi di Daan Gene era significativamente differente (p < 0,05) da a so analisi di riferimentu di laburatoriu.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значитатель
0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Tuttavia, in un studiu in Cina15, i risultati di u test geneticu di Daan eranu significativamente diversi (p < 0,05) paragunati à u so test di laburatoriu di riferimentu.Questa discrepanza pò esse duvuta à a sensibilità di u test di riferimentu per rilevà u SARS-CoV-2, è ulteriori studii ponu esse impurtanti per determinà a causa.
Inoltre, u nostru studiu hà valutatu a prestazione cumparativa di u test SARS-CoV-2 BGI cù CRS, mustrendu un eccellente accordu percentuale pusitivu (PPA = 97,9%), accordu percentuale negativu (NPA = 100%), è accordu percentuale generale per sessu (OPA). = 98,8%). I valori Kappa di Cohen anu mostratu un bonu accordu (K = 0,975). Studi in i Paesi Bassi16 è in Cina15 anu mostratu risultati consistenti. U test SARS-CoV-2 BGI hè un test di rilevazione di un genu unicu (ORF1a/b) chì utilizza 10 µl di eluatu di amplificazione/rilevazione. Malgradu un bonu accordu statisticu cù i nostri risultati di riferimentu, l'analisi hà mancatu dui campioni pusitivi (1,22%) di u campione tutale. Questu pò avè enormi implicazioni cliniche per a dinamica di trasmissione sia à livellu di u paziente sia di a cumunità.
Un'altra analisi comparativa inclusa in questu studiu hè stata u test Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); a percentuale di currispundenza generale era di 96,3%. A forza di l'accordu hè stata ancu determinata da u valore Kappa di Cohen, chì era di 0,925, chì indica un accordu cumpletu cù u CRS. Ancu una volta, i nostri risultati sò identichi à i studii realizati à l'Università Centrale Sud in Changsha, Cina, è à u Dipartimentu di Laboratoriu Clinicu di l'Ospedale Populare di Liuzhou, Città di Liuzhou, Cina17. Ancu s'è a bona concordanza statistica sopra hè stata registrata, u test chi-quadratu (test MacNemar) hà dimustratu chì u risultatu di u test Sansure Biotech hà avutu una differenza statisticamente significativa paragunata à CRS (p < 0,005). Ancu s'è a bona concordanza statistica sopra hè stata registrata, u test chi-quadratu (test MacNemar) hà dimustratu chì u risultatu di u test Sansure Biotech hà avutu una differenza statisticamente significativa paragunata à CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое сототеровано sansure biotech по сравнению с CRS (p < 0,005). Ancu s'è a bona cunfurmità statistica sopra hè stata registrata, u test chi-quadratu (test McNemar) hà dimustratu chì u risultatu di u test Sansure Biotech avia una differenza statisticamente significativa paragunata à u CRS (p < 0,005).Sansure Biotech相比具有统计学显着差异（p < 0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， biotech ， 检验 ，与 crs 相比 具有 显着 （（p <0.005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。＼。。）） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий хи-квадратат) (критерий хи-квадрат) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech è CRS. Malgradu a bona concordanza statistica nutata sopra, u test chi-quadratu (test McNemar) hà mostratu una differenza statisticamente significativa (p < 0,005) trà u test Sansure Biotech è u CRS.Sei campioni (3,66%) sò stati trovati falsi negativi paragunati à CRS (Tabella Supplementare 1); questu hè assai impurtante, soprattuttu data a dinamica di trasmissione di u virus. I dati sopra citati sustenenu ancu questu bassu tassu di rilevazione15.
In questu studiu, i valori Ct sò stati determinati per ogni test è a rispettiva piattaforma, cù u valore mediu Ct u più bassu riportatu in u test Abbott SARS-CoV-2. Questu risultatu pò esse ligatu à u sistema di test geneticu cumminatu simultaneu di Abbott per a rilevazione di SARS-CoV-2. Dunque, secondu a Figura 1, 87,6% di i risultati Abbott SARS-CoV-2 avianu valori Ct inferiori à 20. Solu un picculu numeru di risultati di campioni (12,4%) eranu in a gamma 20-30. I valori Ct superiori à 30 ùn sò stati registrati. In più di l'usu da parte di Abbott di u furmatu di test geneticu di u pannellu SARS-CoV-2, questu risultatu pò esse ligatu à u limite di rilevazione inferiore (32,5 copie di RNA/mL)18, chì hè trè volte inferiore à u limite inferiore di a cumpagnia di 100 copie di RNA/mL.ml)19.
Stu studiu hà qualchì limitazione: prima, ùn avemu micca metudi standard/di riferimentu [cum'è a carica virale o altri testi di laburatoriu (LDA)] per via di a mancanza di risorse. Siconda, tutti i campioni utilizati in questu studiu eranu tamponi nasofaringei, mentre chì i risultati ùn eranu micca applicabili à altri tipi di campioni, è terzu, a dimensione di u nostru campione era chjuca.
Questu studiu hà paragunatu a prestazione di quattru testi rRT-PCR per u SARS-CoV-2 utilizendu campioni nasofaringei. Tutti i testi di rilevazione anu avutu prestazioni quasi paragunabili, à l'eccezzione di u test Sansure Biotech. Inoltre, u bassu tassu di pusitività hè statu identificatu in u test Sansure Biotech paragunatu à u CRS (p < 0,05). Inoltre, u bassu tassu di pusitività hè statu identificatu in u test Sansure Biotech paragunatu à u CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по срав нс, 5 (C. Inoltre, u test Sansure Biotech hà mostratu una bassa percentuale di risultati pusitivi paragunatu à CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p <0.05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p <0.05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по срав нс,5 (CRS,5). Inoltre, u test Sansure Biotech hà avutu un tassu di pusitività più bassu paragunatu à CRS (p < 0,05).L'analisi di Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) di PPA, NPA è accordanza generale hà superatu u 93,5% cù un valore di accordanza di forza Cohen Kappa di 0,925. Infine, u Sansure Biotech Assay (RUO) hà bisognu di ulteriore validazione per l'usu in Etiopia, è una ricerca supplementaria deve esse cunsiderata per valutà l'affermazioni di i singoli pruduttori.
Un cuncepimentu di studiu cumparativu hè statu realizatu in quattru strutture sanitarie in Addis Abeba, l'Ospedale Eka Kotebe, u Centru di Trattamentu di a Chjesa di u Millennium, l'Ospedale Memoriale Zewooditu è ​​l'Ospedale Specialistu in Tuberculosi di San Petru. I dati sò stati raccolti trà u 1 è u 31 di dicembre di u 2020. E strutture mediche per questu studiu sò state scelte apposta in basa à u so numeru elevatu di casi è à a dispunibilità di i principali centri di trattamentu in a cità. In listessu modu, i strumenti, cumpresi i strumenti PCR in tempu reale ABI 7500 è Abbott m2000, sò stati selezziunati secondu e raccomandazioni di i pruduttori di reagenti NAAT, è quattru kit di rilevazione PCR sò stati selezziunati per questu studiu, postu chì a maiò parte di i laboratorii in Etiopia anu utilizatu almenu quattru di elli. Test geneticu, test Abbott SARS-CoV-2, test Sansure Biotech è test SARS-CoV-2 BGI realizati durante u studiu).
I testi per u SARS-CoV-2 sò stati realizati da u 1u à u 30 di dicembre di u 2020 aduprendu 3 ml di Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Cina) da individui sottu investigazione per COVID-19 riferiti à EPHI. I campioni nasofaringei sò stati raccolti da cullettori di campioni furmati è mandati à EPHI in pacchetti tripli. Prima di l'isolamentu di l'acidu nucleicu, à ogni campione hè attribuitu un numeru d'identificazione unicu. L'estrazione hè realizata da ogni campione subitu à l'arrivu aduprendu metudi d'estrazione manuali è automatichi. Cusì, per l'estrazione automatica di Abbott m2000, 1,3 ml (cumpresi 0,8 ml di vulume mortu è 0,5 ml di vulume d'entrata d'estrazione) di u campione sò stati estratti da ogni campione è passati per u Sistema di Preparazione di Campioni di DNA Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). ) Un lottu di 96 [92 campioni, dui cuntrolli di rilevazione è dui cuntrolli senza mudellu (NTC)] hè statu inclusu in u prucessu generale (recuperazione è rilevazione) di dui cicli di SARS-CoV-2 (EUA) in tempu reale. mining. In listessu modu, per l'estrazione manuale, aduprate i stessi campioni (per l'estrazione è a scuperta automatica). Cusì, in tuttu u prucessu, 140 µl di campioni sò stati aliquotati è estratti cù u QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germania) in lotti di 24 (cumpresi 20 campioni, dui cuntrolli di test è dui NTC) in nove cicli. L'eluati estratti manualmente sò stati amplificati è rilevati cù un termociclatore ABI 7500 cù u test SARS-CoV-2 BGI, u test Daan Gene è u test Sansure Biotech.
L'isolamentu è a purificazione automatizati di l'ARN virale SARS-CoV-2 seguitanu u principiu di a perla magnetica utilizendu i reagenti di preparazione di campioni di DNA Abbott. L'inattivazione di i campioni è a solubilizazione di e particelle virali sò realizate utilizendu un detergente chì cuntene isotiocianatu di guanidina per denaturà a proteina è inattivà a RNasi. L'ARN hè tandu siparatu da a proteina per separazione di fase solida utilizendu silice, vale à dì u sale di guanidiniu è u pH alcalinu di u buffer di lisi prumove u ligame di l'acidi nucleichi à a silice (SiO2). A fase di risciacquu elimina e proteine ​​è i detriti rimanenti per pruduce una soluzione chjara. L'ARN trasparente hè isolatu da microparticelle à basa di silice utilizendu u campu magneticu di u strumentu20,21. D’altronde, l'isolamentu manuale è a purificazione di l'ARN sò realizati per mezu di u metudu di a colonna di spin utilizendu a centrifugazione invece di un supportu magneticu è a separazione di e microparticelle da l'eluente.
U test di rilevazione Abbott Real-Time SARS-CoV-2 (Abbott Molecular, Inc.) hè statu realizatu secondu l'istruzzioni di u fabricatore, chì hà ricevutu EUA19,22 da l'OMS è a FDA. In questu protocolu, l'inattivazione di u campione prima di l'estrazione hè stata realizata in un bagnu d'acqua à 56 °C per 30 minuti. Dopu l'inattivazione di u virus, l'estrazione di l'acidu nucleicu hè stata realizata nantu à un strumentu Abbott m2000 SP da 0,5 ml di VTM utilizendu un sistema di preparazione di campioni di DNA Abbott m2000. secondu u fabricatore. L'amplificazione è a rilevazione sò state realizate utilizendu un strumentu Abbott m2000 RT-PCR, è hè stata realizata una doppia rilevazione per i geni RdRp è N. ROX) è VIC P (colorante pruprietariu) per u targeting è a rilevazione di i cuntrolli interni, chì permettenu a rilevazione simultanea di i dui prudutti di amplificazione 19.
U metudu di rilevazione di l'amplificazione di stu kit hè basatu annantu à a tecnulugia RT-PCR in un passu. I geni ORF1a/b è N sò stati selezziunati cum'è regioni cunservate da Daan Gene Technology per rilevà l'amplificazione di a regione bersagliu. Primer specifichi è sonde fluorescenti (sonde di u gene N marcate cù FAM, sonde ORF1a/b marcate cù VIC) sò stati cuncipiti per rilevà l'ARN di u SARS-CoV-2 in i campioni. L'eluente finale è e miscele maestre sò state preparate aghjunghjendu 5 µl di eluente à 20 µl di a miscela maestra finu à un vulume finale di 25 µl. L'amplificazione è a rilevazione sò state realizate simultaneamente nantu à un strumentu PCR in tempu reale ABI 750024.
I geni ORF1a/b è N sò stati rilevati cù u Kit Diagnosticu di l'Acidu Nucleicu Sansure Biotech nCoV-2019 (rilevazione PCR fluorescente). Preparate sonde specifiche per ogni genu bersagliu selezziunendu u canale FAM per a regione ORF1a/b è u canale ROX per u genu N. À questu kit di analisi, l'eluente è i reagenti master mix sò aghjunti cum'è seguita: preparate 30 µl di reagente master mix è 20 µl di campione eluitu per a rilevazione/amplificazione. A PCR in tempu reale ABI 750025 hè stata aduprata per l'amplificazione/rilevazione.
U test SARS-CoV-2 BGI hè un kit rRT-PCR fluorescente in tempu reale per a diagnosi di COVID-19. A regione target si trova in a regione ORF1a/b di u genomu SARS-CoV-2, chì hè un metudu di rilevazione di un solu genu. Inoltre, u genu housekeeping umanu β-actina hè un genu target regulatu internamente. A miscela maestra hè preparata mischjendu 20 µl di u reagente di a miscela maestra è 10 µl di u campione di RNA estrattu in una piastra à pozzetti26. Un strumentu PCR quantitativu in tempu reale fluorescente ABI 7500 hè statu utilizatu per l'amplificazione è a rilevazione. Tutte l'amplificazione di l'acidi nucleici, e cundizioni di esecuzione PCR per ogni test è l'interpretazione di i risultati sò state realizate secondu l'istruzzioni di u rispettivu fabricatore (Tabella 3).
In questa analisi comparativa, ùn avemu micca utilizatu u metudu standard di riferimentu per determinà a percentuale di concordanza (positiva, negativa è generale) è altri parametri di paragone per e quattru analisi. Ogni paragone di test hè statu fattu cù CRS, in questu studiu u CRS hè statu stabilitu da a regula "qualsiasi pusitivu" è u risultatu hè statu determinatu, micca da un unicu test, avemu utilizatu almenu dui risultati di test currispondenti. Inoltre, in u casu di trasmissione di COVID-19, i risultati falsi negativi sò più periculosi cà i risultati falsi pusitivi. Dunque, per dì "positivu" u più precisamente pussibule da un risultatu CRS, almenu dui test devenu esse pusitivi, vale à dì chì almenu un risultatu pusitivu hè prubabile di vene da un test EUA. Cusì, trà quattru risultati di test, dui o più risultati di test chì danu u listessu risultatu sò cunsiderati veri pusitivi o negativi18,27.
I dati sò stati raccolti aduprendu moduli strutturati d'estrazione di dati, l'inserimentu è l'analisi di dati sò stati realizati aduprendu u software statisticu Excel è SPSS versione 23.0 per statistiche descrittive. L'accordu percentuale pusitivu, negativu è generale hè statu analizatu, è un puntu Kappa hè statu utilizatu per determinà u gradu d'accordu di ogni metudu cù CRS. I valori Kappa sò interpretati cusì: 0,01 à 0,20 per un accordu lieve, 0,21 à 0,40 per un accordu generale, 0,41-0,60 per un accordu moderatu, 0,61-0,80 per un accordu maiò è 0,81-0,99 per un accordu cumpletu28.
L'autorizazione etica hè stata ottenuta da l'Università di Addis Abeba è tutti i protokolli sperimentali per questu studiu sò stati appruvati da u Cunsigliu di Revisione Etica Scientifica di l'Istitutu Etiope di Salute Pubblica. U numeru di riferimentu per a Licenza Etica EPHI hè EPHI/IRB-279-2020. Tutti i metudi sò stati applicati in cunfurmità cù e raccomandazioni è e disposizioni di e Linee Guida Naziunali Complete Etiope per u Trattamentu di COVID-19. Inoltre, u cunsensu informatu scrittu hè statu ottenutu da tutti i participanti à u studiu prima di a participazione à u studiu.
Tutti i dati ottenuti o analizzati in questu studiu sò inclusi in questu articulu publicatu. I dati chì sustenenu i risultati di questu studiu sò dispunibili da l'autore rispettivu nantu à una dumanda ragionevule.
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