Prestazione di quattru saggi di amplificazione di l'acidu nucleicu per identificà SARS-CoV-2 in Etiopia

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Dapoi u focu di a malatia coronavirus (COVID-19) di u 2019, parechji testi di amplificazione di l'acidu nucleicu cummerciale (NAAT) sò stati sviluppati in u mondu è sò diventati test standard. Ancu se parechji testi sò stati sviluppati rapidamente è appiicati à e teste di diagnostica di laboratoriu, u rendiment di sti testi ùn hè statu evaluatu in una varietà di paràmetri. Dunque, stu studiu hà u scopu di valutà a prestazione di i saggi Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI è Sansure Biotech utilizendu u Standard di Riferimentu Compositu (CRS). U studiu hè statu realizatu in l'Istitutu di Salute Publica Etiopia (EPHI) da 1 à 30 dicembre 2020. 164 mostri nasofaringeali sò stati estratti cù u QIAamp RNA mini kit è u sistema di preparazione di mostra di DNA Abbott. Di 164 esemplari, 59.1% eranu pusitivi è 40.9% eranu negativi per CRS. A positività di Sansure Biotech era significativamente bassu cumparatu cù CRS (p <0.05). A positività di Sansure Biotech era significativamente bassu cumparatu cù CRS (p <0.05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). I risultati pusitivi di Sansure Biotech eranu significativamente più bassi cumparatu cù CRS (p <0.05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0.05）。 У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech hà avutu significativamente menu risultati pusitivi cumparatu cù CRS (p <0,05).L'accordu generale di e quattru analisi era 96,3-100% cumparatu cù CRS. In più di a bassa positività di l'assay Sansure Biotech, u rendiment di i quattru saggi era quasi paragunabile. Per quessa, l'assay Sansure Biotech [Research Only (RUO)] richiede validazione supplementaria per u so usu in Etiopia. Infine, una ricerca supplementaria deve esse cunsiderata per valutà i saggi cù e pretensioni di u fabricatore appropritatu.
I testi di laboratoriu facenu parte di u Pianu Strategicu di l'Organizazione Mondiale di a Salute (OMS) per a Preparazione è Risposta di Coronavirus 2019 (COVID-19) (SPRP). L'OMS cunsiglia chì i paesi anu bisognu di custruisce a capacità di u laboratoriu per migliurà a preparazione, a gestione curretta di i casi, a vigilanza è a risposta rapida à e sfide di salute publica. Questu suggerisce chì u rolu di u laboratoriu hè chjave per caratterizà a malatia è l'epidemiologia di l'agenti infettivi emergenti è cuntrullà a so diffusione.
U diagnosticu di COVID-19 richiede infurmazione epidemiologica è medica, sintomi / segni persunali, è dati radiografichi è di laboratoriu2. Dapoi u focu di COVID-19 hè statu signalatu in Wuhan, Cina, parechji testi di amplificazione di l'acidu nucleicu cummerciale (NAAT) sò stati sviluppati in u mondu. A reazione in catena di polimerasi di trascrizione inversa in tempu reale (rRT-PCR) hè stata aduprata cum'è un metudu di rutina è standard per u diagnosticu di laboratoriu di l'infezione di u sindromu respiratoriu acutu severu 2 (SARS-CoV-2)3. A rilevazione moleculare di SARS-CoV-2 hè tipicamente basata nantu à i geni N (gene di proteina nucleocapside), E (gene di proteina di busta) è RdRp (gene di RNA polimerasi dipendente da RNA) in ORF1a/b (quadru di lettura aperta 1a/b) . gene) regione identificata da u genoma virali. Sò cunsiderate cum'è e principali regioni cunservate truvate in i genomi virali per a ricunniscenza di virus4. Frà questi geni, i geni RdRp è E anu una alta sensibilità di rilevazione analitica, mentri u genu N hà una sensibilità analitica bassa5.
A prestazione di i saggi PCR pò varià secondu diversi fattori, cum'è: reagenti di estrazione, reagenti di amplificazione / rilevazione, metudu di estrazione, qualità di a macchina PCR è altri strumenti. Da aprile 2020, più di 48 dispusitivi di diagnostichi differenti da nove paesi anu ricevutu Autorizazione d'Usu d'Urgenza (EUA) per diagnostichi COVID-196. In Etiopia, più di 14 piattaforme PCR in tempu reale sò aduprate per a rilevazione PCR di SARS-CoV-2 in 26 istituzioni di salute publica, cumprese ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 è Quant-studio7. Inoltre, diversi kit di test PCR sò dispunibili, cum'è u test Daan Gene, u test Abbott SARS-CoV-2, u test Sansure Biotech è u test SARS-CoV-2 BGI. Ancu s'è rRT-PCR hè assai sensibile, certi pazienti cun COVID-19 riportanu risultati falsi negativi per via di copie insufficiente di l'acidu ribonucleicu virali (RNA) in campioni per via di cullizzioni, trasportu, almacenamentu è manipulazione impropriu, è testi di laboratoriu. cundizioni è azzioni di u persunale8. Inoltre, a manipolazione di campioni o di cuntrollu, a soglia di u ciclu (Ct) è a reattività incruciata cù altri acidi nucleici patogeni o RNA SARS-CoV-2 inattivu / residuale pò purtà à risultati falsi pusitivi in ​​i saggi rRT-PCR9. Cusì, hè chjaru chì e teste di PCR ponu veramente identificà i trasportatori di frammenti di geni, postu chì ùn ponu mancu distingue trà i geni virali veramente attivi, cusì i testi ponu identificà solu i trasportatori è micca i pazienti10. Per quessa, hè impurtante per valutà a prestazione di diagnostica cù metudi standard in u nostru ambiente. Ancu se parechji reagenti NAAT sò dispunibuli à l'Istitutu di Salute Pùbblica Etiope (EPHI) è in tuttu u paese, nisuna valutazione comparativa di a so efficacità hè stata rappurtata. Per quessa, stu studiu hà u scopu di valutà a prestazione comparativa di i kit dispunibili in u cummerciu per a rilevazione di SARS-CoV-2 da rRT-PCR utilizendu campioni clinichi.
Un totale di 164 participanti cù suspettati COVID-19 sò stati inclusi in stu studiu. A maiò parte di e mostre eranu da i centri di trattamentu (118/164 = 72%), mentri l'altri 46 (28%) participanti eranu da i centri non-trattamentu. Trà i participanti micca trattati in u centru, 15 (9.1%) avianu casi clinicamente suspettati è 31 (18.9%) avianu cuntatti di casi cunfirmati. Novanta trè (56.7%) participanti eranu masci, è l'età media (± SD) di i participanti era 31.10 (± 11.82) anni.
In questu studiu, i tassi pusitivi è negativi di quattru teste per COVID-19 sò stati determinati. Cusì, i tassi pusitivi di l'assay Abbott SARS-CoV-2, l'analisi Daan Gene 2019-nCoV, l'analisi SARS-CoV-2 BGI, è l'assay Sansure Biotech 2019-nCoV eranu rispettivamente di 59,1%, 58,5%, 57,9% è 55,5%. . I punteggi di standard di riferimentu compostu pusitivu è negativu (CRS) eranu 97 (59.1%) è 67 (40.9%), rispettivamente (Table 1). In questu studiu, a definizione di CRS hè stata basata nantu à a regula "qualsiasi pusitivu", per quale fora di quattru risultati di teste, dui o più risultati di teste chì anu datu u stessu risultatu sò cunsiderati veru pusitivi o negativi.
In questu studiu, avemu truvatu un accordu percentuale negativu (NPA) di 100% (95% CI 94.6-100) per tutti l'analisi cumparatu cù CRS. L'analisi Sansure Biotechnology hà dimustratu un PPA minimu di 93,8% (95% CI 87,2-97,1) è l'analisi Daan Gene 2019-nCoV hà avutu un accordu generale di 99,4% (95% CI 96,6-99,9). In cuntrastu, l'accordu generale trà u test SARS-CoV-2 BGI è u test Sansure Biotech 2019-nCoV era 98.8% è 96.3%, rispettivamente (Tabella 2).
U coefficient d'accordu kappa di Cohen trà i risultati di l'analisi CRS è Abbott SARS-CoV-2 era cumplettamente coerente (K = 1.00). In listessu modu, i valori kappa di Cohen rilevati da Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI, è Sansure Biotech 2019-nCoV sò ancu cumpletamente coerenti cù CRS (K ≥ 0,925). In questa analisi comparativa, u test chi-square (test McNemar) hà dimustratu chì i risultati di l'analisi Sansure Biotech 2019-nCoV eranu significativamente sfarenti da i risultati CRS (p = 0.031) (Tabella 2).
Comu mostra in Fig.1, u percentualità di u valore Ct più bassu (< 20 Ct) di l'analisi Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp è N cumminatu) era di 87,6% è u valore Ct di u gene ORF1a/b di u test Sansure Biotech 2019-nCoV hà dimustratu chì u percentualità di bassa U valore Ct (< 20 Ct) era 50,3% è u valore Ct altu (36-40 Ct) era 3,2%. 1, u percentualità di u valore Ct più bassu (< 20 Ct) di l'analisi Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp è N cumminatu) era di 87,6% è u valore Ct di u gene ORF1a/b di u test Sansure Biotech 2019-nCoV hà dimustratu chì u percentualità di bassa U valore Ct (< 20 Ct) era 50,3% è u valore Ct altu (36-40 Ct) era 3,2%.Comu mostra in Fig.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N, 6%,со и N) значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 2019-nCoV) вя, 20% а высокое значение Ct (36-40 Ct) составляло 3,2%. 1, u percentualità di l'analisi di u valore Ct più bassu (< 20 Ct) di Abbott SARS-CoV-2 (genu cumminatu RdRp è N) era 87,6%, è u valore Ct di l'analisi di u gene ORF1a/b di Sansure Biotech 2019-nCoV hà dimustratu. chì u pircintuali di u valore Ct bassu (< 20 Ct) hà cuntatu 50,3%, è u valore Ct altu. (36-40 Ct) rapprisentanu 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20%，San Biotech，876. 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，4高Ct 值(36)–4高Ct 值(36)的百分比为3.2%。 Comu mostra in a Figura 1, u percentualità di u valore Ct più bassu (< 20 Ct) di u test Abbott SARS-CoV-2 (combinazione di u gene RdRp è N) hè di 87,6%, u valore Ct di u gene ORF1a/b di u test Sansure Biotech 2019-nCoV. mostra una bassa Ct值(< 20 Ct) 的 percentuale hè 50,3%,高Ct 值(36–40 Ct) 的 percentuale hè 3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое низкое на праза Ct (< 20 Ct) в размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV покализ nCoV покат. Comme le montre la figure 1, l'essai Abbott SARS-CoV-2 (combinant les gènes RdRp et N) avait le plus faible pourcentage de valeur Ct (< 20 Ct) à 87,6 %, tandis que la valeur Ct du gène ORF1a/b dans le Sansure Studiu Biotech 2019 - L'analisi di nCoV hà dimustratu un Ct bassu. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких значений Ct (36-40 Ct) составил составил 2%. U percentuale di valori (< 20 Ct) era 50,3%, è u percentualità di valori Ct elevati (36-40 Ct) era 3,2%.U test Abbott SARS-CoV-2 B hà registratu valori Ct sopra 30. Per d 'altra banda, nantu à l'assay BGI SARS-CoV-2, u genu ORF1a/b hà avutu un altu valore Ct (> 36 Ct) u percentualità era 4% (Fig. 1). Per d 'altra banda, nantu à l'assay BGI SARS-CoV-2, u genu ORF1a/b hà avutu un altu valore Ct (> 36 Ct) u percentualità era 4% (Fig. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент ковот 4% (рис. 1). Per d 'altra banda, in l'analisi di u genu BGI SARS-CoV-2 ORF1a/b hà avutu un altu valore Ct (> 36 Ct), u percentuale di quale era 4% (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比（分比一4% Per d 'altra banda, in a rilevazione BGI SARS-CoV-2, u percentualità di u genu ORF1a/b cù un altu valore Ct (> 36 Ct) hè di 4% (Figura 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) со. 4% (висо. 4%). Per d 'altra banda, in l'analisi BGI SARS-CoV-2, u percentualità di genes ORF1a/b cù alti valori Ct (> 36 Ct) era 4% (Fig. 1).
In questu studiu, avemu pigliatu 164 mostri nasofaringeali. Per tutti i tipi di saggi, l'isolamentu di l'RNA è l'amplificazione sò stati realizati cù i metudi è i kit cunsigliati da i rispettivi fabbricanti.
Stu studiu hà dimustratu chì a prova di Abbott per SARS-CoV-2 hà a stessa prestazione di rilevazione cum'è CRS, cun 100% cuncordanza positiva, negativa è generale. L'accordu kappa di Cohen hè 1.00, chì indica un accordu cumpletu cù CRS. Un studiu simile da l'Università di Washington in i Stati Uniti hà truvatu chì a sensibilità generale è a specificità di a prova Abbott per SARS-CoV-2 era 93% è 100%, rispettivamente, cumparatu cù l'assay determinatu da u laboratoriu (LDA) di u CDC. . 11. U sistema di deteczione Abbott SARS-CoV-2 hè basatu annantu à a deteczione simultanea cumminata di i geni N è RdRp, postu chì i dui geni sò più sensittivi, minimizendu falsi negativi12. Un studiu in Vienna, Austria hà ancu dimustratu chì grandi volumi di campioni di estrazione è volumi di l'eluenti di rilevazione minimizavanu l'effetti di diluzione è aumentanu l'efficienza di rilevazione13. Cusì, l'accordu perfettu di Abbott per l'analisi SARS-CoV-2 pò esse assuciatu cù un sistema di rilevazione di piattaforma chì rileva simultaneamente i geni combinatori, estrae un gran numaru di campioni (0,5 ml), è usa una grande quantità di eluente (40 µl).
I nostri risultati anu ancu dimustratu chì a prestazione di rilevazione di a prova genetica Daan era quasi uguale à quella di CRS. Questu hè coherente cù un studiu14 realizatu à l'Università Anhui in Huainan, Cina, è a pretendenza di u fabricatore di un accordu pusitivu 100%. Malgradu i rapporti di risultati coerenti, un campione hè statu falsu negativu dopu à ritestà u listessu eluate, ma era pusitivu in i saggi Abbott SARS-CoV-2 è Sansure Biotech nCoV-2019. Questu suggerisce chì ci pò esse una variabilità in i risultati in diversi tipi di saggi. Tuttavia, in u studiu realizatu in Cina15, u risultatu di l'assay di Daan Gene era significativamente sfarente (p < 0.05) paragunatu à u so test di riferimentu definitu da u laboratoriu. Tuttavia, in u studiu realizatu in Cina15, u risultatu di l'assay di Daan Gene era significativamente sfarente (p < 0.05) paragunatu à u so test di riferimentu definitu da u laboratoriu. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значитенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значитенном () значитенном (5) их лабораторного эталонного анализа. Tuttavia, in un studiu in China15, u risultatu di l'analisi di Daan Gene era significativamente sfarente (p <0.05) da a so analisi di riferimentu di laboratoriu.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значитатель <br> 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. In ogni casu, in un studiu in Cina15, i risultati di a prova genetica di Daan eranu significativamente sfarente (p <0.05) paragunatu à a so prova di laboratoriu di riferimentu.Questa discrepanza pò esse dovuta à a sensibilità di a prova di riferimentu per detectà SARS-CoV-2, è altri studii ponu esse impurtanti per determinà a causa.
Inoltre, u nostru studiu hà valutatu a prestazione comparativa di l'assay SARS-CoV-2 BGI cù CRS, chì mostra un eccellente accordu percentuale pusitivu (PPA = 97.9%), accordu percentuale negativu (NPA = 100%), è accordu percentuale generale per genere ( OPA). ). = 98,8%). I valori Kappa di Cohen anu mostratu un bonu accordu (K = 0,975). Studi in Olanda16 è Cina15 anu dimustratu risultati consistenti. U test SARS-CoV-2 BGI hè un test di rilevazione di un genu unicu (ORF1a/b) utilizendu 10 µl d'eluate di amplificazione/deteczione. Malgradu un bonu accordu statisticu cù i nostri risultati di riferimentu, l'analisi mancava dui campioni pusitivi (1.22%) di a mostra tutale. Questu pò avè enormi implicazioni cliniche per a dinamica di trasmissione à u livellu di u paziente è di a cumunità.
Un'altra analisi comparativa inclusa in stu studiu hè stata l'assay Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); u percentuale di partita generale era 96,3%. A forza di l'accordu era ancu determinata da u valore Kappa di Cohen, chì era 0,925, chì indicanu un accordu cumpletu cù u CRS. In novu, i nostri risultati sò identici à i studii realizati in l'Università Central South in Changsha, Cina, è in u Dipartimentu di Laboratoriu Clinicu di l'Hospital di Liuzhou People, Liuzhou City, China17. Ancu s'è a bona cuncordanza statistica sopra hè stata registrata, a prova di chi-square (test MacNemar) hà dimustratu chì u risultatu di l'assay Sansure Biotech hà avutu una diferenza statisticamente significativa cumparatu cù CRS (p <0,005). Ancu s'è a bona cuncordanza statistica sopra hè stata registrata, a prova di chi-square (test MacNemar) hà dimustratu chì u risultatu di l'assay Sansure Biotech hà avutu una diferenza statisticamente significativa cumparatu cù CRS (p <0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое сототеровано sansure biotech по сравнению с CRS (p < 0,005). Ancu se u bonu accordu statisticu sopra hè statu registratu, a prova di chi-square (test McNemar) hà dimustratu chì u risultatu di l'assay Sansure Biotech hà avutu una diferenza statisticamente significativa cumparatu cù u CRS (p <0.005).Sansure Biotech相比具有统计学显着差异（p < 0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， biotech ， 检验 ，与 crs 相比 具有 显着 （（p <0.005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。＼。。）） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий хи-квадратат) (критерий хи-квадрат) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech è CRS. Malgradu u bonu accordu statisticu nutatu sopra, u test chi-square (test McNemar) hà dimustratu una diferenza statisticamente significativa (p <0.005) trà l'assay Sansure Biotech è u CRS.Sei campioni (3.66%) sò stati trovati falsi negativi cumparatu cù CRS (Tabella Supplementaria 1); questu hè assai impurtante, soprattuttu datu a dinamica di trasmissione di u virus. I dati di sopra sustene ancu sta bassa rata di rilevazione15.
In questu studiu, i valori Ct sò stati determinati per ogni analisi è rispettiva piattaforma, cù u valore Ct mediu più bassu rappurtatu in l'assay Abbott SARS-CoV-2. Stu risultatu pò esse ligatu à u sistema di teste genetica cumminata simultanea di Abbott per a rilevazione di SARS-CoV-2. Per quessa, secondu a Figura 1, 87.6% di i risultati Abbott SARS-CoV-2 avianu valori Ct sottu à 20. Solu un pocu numeru di risultati di mostra (12.4%) eranu in a gamma 20-30. I valori Ct sopra 30 ùn sò micca stati registrati. In più di l'usu di Abbott di u furmatu di teste geneticu di u pannellu SARS-CoV-2, stu risultatu pò esse ligatu à u limitu di rilevazione più bassu (32,5 copie RNA/mL)18, chì hè trè volte più bassu cà u limitu minimu di a cumpagnia di 100 copie RNA. /mL. ml) 19.
Stu studiu hà alcune limitazioni: prima, ùn avemu micca metudi standard / di riferimentu [cum'è a carica virali o altre teste di laboratori (LDA)] per mancanza di risorse. Siconda, tutti i specimens utilizati in stu studiu eranu tamponi nasofaringeali, mentri i risultati ùn eranu micca applicabili à altri tipi di specimen, è terzu, a nostra dimensione di mostra era chjuca.
Stu studiu hà paragunatu a prestazione di quattru saggi rRT-PCR per SARS-CoV-2 utilizendu campioni nasofaringei. Tutti i saggi di rilevazione anu avutu prestazioni quasi paragunabili, eccettu l'assay Sansure Biotech. Inoltre, a bassa positività hè stata identificata in l'assay Sansure Biotech cumparatu cù u CRS (p < 0,05). Inoltre, a bassa positività hè stata identificata in l'assay Sansure Biotech cumparatu cù u CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по срав нс, 5 (C. Inoltre, a prova Sansure Biotech hà dimustratu un bassu percentualità di risultati pusitivi cumparatu cù CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p <0.05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p <0.05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по срав нс,5 (CRS,5). Inoltre, l'assay Sansure Biotech hà avutu un tassu di positività più bassu cumparatu cù CRS (p <0.05).L'analisi Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) di PPA, NPA è l'accordu generale superava u 93.5% cù una forza di Cohen Kappa di valore di accordu di 0.925. Infine, u Sansure Biotech Assay (RUO) hà bisognu di più validazione per l'usu in Etiopia, è una ricerca supplementaria deve esse cunsiderata per valutà e rivendicazioni da i pruduttori individuali.
U disignu di studiu comparativu hè statu realizatu in quattru strutture sanitarie in Addis Abeba, Eka Kotebe Hospital, Millennium Church Treatment Center, Zewooditu Memorial Hospital è St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital. I dati sò stati raccolti trà u 1 di dicembre è u 31 di dicembre di u 2020. I servizii medichi per stu studiu sò stati scelti apposta nantu à u so altu numeru di casi è a dispunibilità di i centri di trattamentu maiò in a cità. In listessu modu, strumenti, cumprese l'ABI 7500 è l'Abbott m2000 PCR in tempu reale, sò stati scelti secondu e raccomandazioni di i fabricatori di reagenti NAAT, è quattru kit di rilevazione PCR sò stati scelti per stu studiu, postu chì a maiò parte di i laboratorii in Etiopia anu utilizatu almenu almenu. quattru di elli. Test geneticu, test Abbott SARS-CoV-2, test Sansure Biotech, è test SARS-CoV-2 BGI realizatu durante u studiu).
A prova per SARS-CoV-2 hè stata realizata da l'1 à u 30 dicembre 2020 cù 3 ml di Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Cina) da individui investigati per COVID-19 riferiti à EPHI. I campioni nasofaringeali sò stati raccolti da cullettori di mostra furmati è mandati à EPHI in pacchetti tripli. Prima di l'isolamentu di l'acidu nucleicu, ogni mostra hè assignatu un numeru d'identificazione unicu. L'estrazione hè realizata da ogni mostra immediatamente à l'arrivu cù metudi di estrazione manuale è automaticu. Cusì, per l'estrazione automatica di Abbott m2000, 1,3 ml (cumprese 0,8 ml di volume mortu è 0,5 ml di volume d'entrata d'estrazione) di a mostra hè stata estratta da ogni mostra è passata à traversu u Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). ) Un batch of 96 [92 samples, two detection controls and two non-template controls (NTC)] hè statu inclusu in u prucessu generale (recuperazione è rilevazione) di duie volte di SARS-CoV-2 (EUA) in tempu reale. minieri. In listessu modu, per l'estrazione manuale, utilizate i stessi campioni (per l'estrazione automatica è a scuperta). Cusì, in tuttu u prucessu, i campioni di 140 µl sò stati aliquotati è estratti cù u QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germania) in lotti di 24 (cumprese 20 campioni, dui cuntrolli di analisi è dui NTC) in nove volte. L'eluate estratti manualmente sò stati amplificati è rilevati utilizendu un termociclatore ABI 7500 utilizendu un test SARS-CoV-2 BGI, un test Daan Gene è un test Sansure Biotech.
L'isolamentu automatizatu è a purificazione di l'RNA virale SARS-CoV-2 segue u principiu di a perla magnetica utilizendu reagenti di preparazione di campioni di DNA Abbott. L'inattivazione di i campioni è a solubilizazione di e particelle virali hè realizatu cù un detergente chì cuntene guanidine isothiocyanate per denature a proteina è inattivate RNase. L'ARN hè allora separatu da a proteina per a separazione di a fase solida cù a silice, vale à dì u sal di guanidinium è u pH alkaline di u buffer di lisi prumove a ligame di l'acidi nucleici à a silice (SiO2). U passu di risciacquare elimina e proteine ​​​​è i residui rimanenti per pruduce una soluzione clara. L'RNA trasparente hè isolatu da microparticelle basate in silice utilizendu u campu magneticu di l'instrumentu20,21. Per d 'altra banda, l'isolamentu manuale è a purificazione di l'RNA hè realizatu da u metudu di a colonna spin cù centrifugazione invece di un stand magneticu è a separazione di microparticelle da l'eluente.
U Test di Rilevazione SARS-CoV-2 in Tempu Reale di Abbott (Abbott Molecular, Inc.) hè statu realizatu secondu l'istruzzioni di u fabricatore, chì hà ricevutu EUA19,22 da l'OMS è a FDA. In questu protocolu, l'inattivazione di mostra prima di l'estrazione hè stata realizata in un bagnu d'acqua à 56 ° C per 30 min. Dopu l'inattivazione di virus, l'estrazione di l'acidu nucleicu hè stata realizata nantu à un strumentu Abbott m2000 SP da 0,5 ml VTM utilizendu un sistema di preparazione di campioni di DNA Abbott m2000. secondu u fabricatore. L'amplificazione è a rilevazione sò state realizate cù un strumentu Abbott m2000 RT-PCR, è a doppia rilevazione hè stata realizata per i geni RdRp è N. ROX) è VIC P (tinttura propria) per u targeting è a deteczione di cuntrolli interni, chì permettenu a deteczione simultanea di i dui prudutti di amplificazione 19 .
U metudu di rilevazione di amplificazione di stu kit hè basatu annantu à a tecnulugia RT-PCR in un passu. I geni ORF1a/b è N sò stati scelti cum'è regioni cunservate da Daan Gene Technology per detectà l'amplificazione di a regione di destinazione. Primers specifici è sonde fluorescenti (sonde di gene N marcate cù FAM, sonde ORF1a/b marcate cù VIC) sò stati cuncepiti per detectà l'RNA SARS-CoV-2 in campioni. L'éluant final et les mélanges maîtres ont été préparés en ajoutant 5 µl d'éluant à 20 µl de mélange maître à un volume final de 25 µl. L'amplificazione è a rilevazione sò state realizate simultaneamente nantu à un strumentu PCR in tempu reale ABI 750024.
I geni ORF1a/b è N sò stati rilevati cù u Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (rilevazione di PCR fluorescente). Preparate sonde specifiche per ogni genu di destinazione selezziunate u canali FAM per a regione ORF1a/b è u canali ROX per u genu N. A stu kit di analisi, l'eluente è i reagenti di mistura maestra sò aghjuntu cum'è seguente: preparanu 30 µl di reagenti di mistura maestra è 20 µl di campione eluitu per a rilevazione/amplificazione. A PCR in tempu reale ABI 750025 hè stata utilizata per amplificazione / rilevazione.
U test SARS-CoV-2 BGI hè un kit rRT-PCR fluorescente in tempu reale per u diagnosticu di COVID-19. A regione di destinazione hè situata in a regione ORF1a/b di u genoma SARS-CoV-2, chì hè un metudu di rilevazione di genu unicu. In più, u genu di a casa umana β-actina hè un genu di destinazione regulatu internamente. Le mélange maître est préparé en mélangeant 20 µl du réactif du mélange maître et 10 µl de l'échantillon d'ARN extrait dans un puits26. Per l'amplificazione è a rilevazione hè stata utilizata un strumentu di PCR in tempu reale fluorescente ABI 7500. Tutte l'amplificazione di l'acidu nucleicu, e cundizioni di esecuzione di PCR per ogni analisi, è l'interpretazione di i risultati sò stati realizati secondu l'istruzzioni rispettivi di u fabricatore (Tabella 3).
In questa analisi comparativa, ùn avemu micca usatu u metudu standard di riferimentu per determinà l'accordu per centu (pusitivu, negativu è generale) è altri paràmetri di paraguni per i quattru analisi. Ogni paraguni di teste hè stata fatta cù CRS, in questu studiu u CRS hè statu stabilitu da a regula "qualsiasi pusitivu" è u risultatu hè statu determinatu, micca da una sola prova, avemu usatu almenu dui risultati di teste currispondenti. Inoltre, in u casu di a trasmissione COVID-19, i risultati falsi negativi sò più periculosi cà i risultati falsi pusitivi. Dunque, per dì "pusitivu" u più precisu pussibule da un risultatu CRS, almenu dui testi di analisi deve esse pusitivi, significatu chì almenu un risultatu pusitivu hè prubabilmente vene da un test EUA. Cusì, fora di quattru risultati di teste, dui o più risultati di teste chì dà u stessu risultatu sò cunsiderati veru pusitivi o negativi18,27.
I dati sò stati raccolti cù forme di estrazione di dati strutturati, l'ingressu è l'analisi di dati sò stati realizati cù u software statisticu Excel è a versione SPSS 23.0 per statistiche descrittive. L'accordu per centu pusitivu, negativu è generale sò stati analizati, è un puntu Kappa hè stata utilizata per determinà u gradu di accordu di ogni metudu cù CRS. I valori Kappa sò interpretati cum'è seguente: 0,01 à 0,20 per accordu ligeru, 0,21 à 0,40 per accordu generale, 0,41-0,60 per accordu moderatu, 0,61-0,80 per accordu maiò è 0,81-0,99 per accordu cumpletu28.
L'autorizazione etica hè stata ottenuta da l'Università di Addis Abeba è tutti i protokolli sperimentali per stu studiu sò stati appruvati da u Cunsigliu di Revisione Scientifica di l'Etica di l'Istitutu di Salute Publica Etiope. U numeru di riferimentu per a Licenza Etica EPHI hè EPHI/IRB-279-2020. Tutti i metudi sò stati applicati in cunfurmità cù e raccomandazioni è e disposizioni di e Linee Naziunali Comprehensive Etiopi per u Trattamentu di COVID-19. Inoltre, u cunsensu infurmatu scrittu hè statu ottenutu da tutti i participanti di studiu prima di a participazione à u studiu.
Tutti i dati ottenuti o analizati in stu studiu sò inclusi in questu articulu publicatu. I dati chì sustenenu i risultati di stu studiu sò dispunibuli da u rispettivu autore nantu à una dumanda ragionevule.
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