Fattori d'interferenza in e reazioni PCR

Durante a reazzione PCR, certi fatturi interferenti sò spessu scontri.
A causa di a sensibilità assai alta di a PCR, a contaminazione hè cunsiderata cum'è unu di i fatturi più impurtanti chì affettanu i risultati di a PCR è pò pruduce risultati falsi pusitivi.
Ugualmente critichi sò e diverse fonti chì portanu à risultati falsi negativi. Se una o più parte essenziale di a mistura di PCR o a reazione di amplificazione stessa sò inibiti o interferiti, l'assay diagnosticu pò esse impeditu. Questu pò purtà à efficienza ridutta è ancu risultati falsi negativi.
In più di l'inibizione, a perdita di l'integrità di l'acidu nucleicu di destinazione pò accade per via di e cundizioni di spedizione è / o di almacenamento prima di a preparazione di mostra. In particulare, l'alte temperature o l'almacenamiento inadegwate pò purtà à danni di e cellule è l'acidi nucleici. A fissazione di cellule è tissuti è l'incrustazione di paraffina sò cause ben cunnisciute di frammentazione di l'ADN è un prublema persistente (vede Figure 1 è 2). In questi casi, ancu l'isolamentu ottimali è a purificazione ùn aiutanu micca.

Figura 1 | Effettu di l'immobilizazione nantu à l'integrità di DNA
L'elettroforesi di gel d'agarose hà dimustratu chì a qualità di l'ADN isolatu da e sezioni di paraffina di l'autopsie variava considerablemente. DNA di diverse lunghezze medie di frammenti era presente in l'estratti secondu u metudu di fissazione. L'ADN hè stata cunservata solu quandu hè stata fissata in campioni congelati nativi è in formalina neutrale tamponata. L'usu di un fermu àcitu Bouin fixative o unbuffered, formalin àcitu formicu-contenente risultatu in una perdita significativu di DNA. A frazione restante hè assai frammentata.
A manca, a durata di i frammenti hè espressa in coppie di kilobase (kbp)

Figura 2 | Perdita di l'integrità di i miri di l'acidu nucleicu
(a) Un gap di 3′-5′ in i dui filamenti risulterà in una rottura in l'ADN di destinazione. A sintesi di l'ADN serà sempre in u picculu fragmentu. In ogni casu, se un situ di annealing primer hè mancante nantu à u frammentu di DNA, solu l'amplificazione lineare si trova. In u casu più favurevule, i frammenti ponu risaturate l'altri, ma i renditi seranu chjuchi è sottu à i livelli di deteczione.
(b) A perdita di basi, principalmente per a depurinazione è a furmazione di dimer di timidina, porta à una diminuzione di u numeru di ligami H è una diminuzione di Tm. Duranti a fase di riscaldamentu allungata, i primers si fonderanu luntanu da l'ADN di a matrice è ùn anu micca annea ancu in cundizioni menu strette.
(c) Basi di timina adiacenti formanu un dimero TT.
Un altru prublema cumuni chì spessu si trova in a diagnostica moleculare hè a liberazione menu ottima di l'acidi nucleici di destinazione cumparatu cù l'estrazione di fenol-cloroformu. In casi estremi, questu pò esse assuciatu cù falsi negativi. Moltu tempu pò esse salvatu da a lisi di ebollizione o a digestione enzimatica di i detriti di e cellule, ma stu metudu spessu si traduce in una bassa sensibilità di PCR per una liberazione insufficiente di l'acidu nucleicu.

Inibizione di l'attività di polimerasi durante l'amplificazione

In generale, l'inibizione hè aduprata cum'è cuncettu di cuntainer per descriverà tutti i fatturi chì portanu à risultati PCR suboptimali. In un sensu strettamente biochimicu, l'inibizione hè limitata à l'attività di l'enzima, vale à dì, riduce o impedisce a cunversione di u sustrato-prodottu attraversu l'interazzione cù u situ attivu di l'ADN polimerasi o u so cofattore (per esempiu, Mg2 + per Taq DNA polimerasi).
I cumpunenti in a mostra o diversi buffers è estratti chì cuntenenu reagenti ponu inibisce direttamente l'enzima o intrappulà i so cofattori (per esempiu EDTA), inattivendu cusì a polimerasi è à u turnu purtendu à risultati PCR negativi o falsi negativi.
Tuttavia, assai interazzioni trà cumpunenti di reazione è acidi nucleici chì cuntenenu target sò ancu designati cum'è "inibitori di PCR". Quandu l'integrità di a cellula hè disturbata da l'isolamentu è l'acidu nucleicu hè liberatu, l'interazzione trà a mostra è a so suluzione circundante è a fase solida ponu accade. Per esempiu, "scavengers" ponu unisce l'ADN monofila o doppia per interazzione non covalente è interferiscenu cù l'isolamentu è a purificazione riducendu u numeru di miri chì eventualmente ghjunghjenu à u vasu di reazione PCR.
In generale, l'inibitori di PCR sò prisenti in a maiò parte di i fluidi di u corpu è i reagenti utilizati per i testi di diagnostichi clinichi (urea in l'urina, hemoglobina è heparina in sangue), supplementi dietetichi (cumpunenti organici, glicogenu, grassu, ioni Ca2 +) è cumpunenti in l'ambiente (fenoli). , metalli pesanti)

Inibitori di PCR più prevalenti ponu esse truvati in batteri è cellule eucariote, DNA non-target, macromolecule di DNA-binding di matrici di tissuti è equipaggiu di laboratoriu cum'è guanti è plastichi. A purificazione di l'acidi nucleici durante o dopu l'estrazione hè u metudu preferitu per sguassà l'inibitori di PCR.
Oghje, diversi equipaghji d'estrazione automatizati ponu rimpiazzà parechji protokolli manuali, ma 100% di ricuperazione è / o purificazione di i miri ùn hè mai stata ottenuta. L'inhibitori potenziali pò esse sempre prisenti in l'acidi nucleici purificati o pò avè digià fattu effettu. Esistenu diverse strategie per riduce l'impattu di l'inhibitori. A scelta di a polimerasi adattata pò avè un impattu significativu in l'attività inhibitore. Altri metudi pruvati per riduce l'inibizione di a PCR aumentanu a concentrazione di polimerasi o l'applicà additivi cum'è BSA.
L'inhibizione di e reazzioni PCR pò esse dimustrata da l'usu di u cuntrollu di qualità di u prucessu internu (IPC).
Ci vole à piglià cura di caccià tutti i reagenti è altre soluzioni in u kit d'estrazione, cum'è etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol è fenol, da l'isolatu di l'acidu nucleicu per un passu di lavatu minuziu. Sicondu a so cuncentrazione, ponu attivà o inibisce a PCR.