Fattori interferenze in reazzione PCR

Durante a reazione PCR, alcuni fattori interferiscenu sò spessu incontrati.
A causa di l'alta sensibilità di PCR, a contaminazione hè cunsiderata cum'è unu di i fattori più impurtanti afecta risultati di pcr è ponu pruduce falsi risultati pusitivi.
Ugualmente critichi sò e diverse fonti chì portanu à i risultati falsi negativi. Sì unu o più parti essenziali di u mischju di u pcrcentu o a reazione di l'amplificazione stessu sò inibiti o interferiti, l'assai diagnosticu pò esse impeditu. Questu pò purtà à l'efficienza ridutta è ancu falsi risultati negativi.
In più di inibizione, a perdita di l'integrità di l'acidu nucleicu di destinazione pò accade per spedizione è / o cundizioni di almacenamentu prima di a preparazione di mostra. In particulare, alta temperature o almacenamentu inadegwatu pò purtà à i danni di e cellule è di l'acidi nucleichi. A fissazione di e cellulari è i tessuti è a paraffina hè ben cunnisciuta di e fornimentu di DNA è un prublema persistente (vede figure 1 è 2). In questi casi, ancu l'isulazione ottima è a purificazione ùn aiutanu micca.

Figura 1 | Effettu di immobilizazione nantu à l'integrità DNA
Agarose Gel Electrophorresis hà dimustratu chì a qualità di l'a ADNA hè isolata da e sezzioni di paraffina di autopsies varied. L'ADNA di diverse lunghezze di frammenti media era presente in l'estratti secondu u metudu di fissazione. L'ADN hè stata priservata solu quandu fissata in mostri congelati nativi è in Formalina Neutrale Buffered. L'usu di un riparazione di bouin forte o unbuffed, formale formale formale hà risultatu in una perdita significativa di DNA. A frazione restante hè altamente frammentata.
A sinistra, a lunghezza di i frammenti sò spressi in coppia di kilobase (KBP)

Figura 2 | Perdita di integrità di i miri di l'acidu nucleichi
(a) una lacuna di 3'-5 'nantu à i dui strati resultanu in una pausa in u DNA di destinazione. Sintesi di l'ADN hà sempre accadutu in u picculu frammentu. Eppuru, se un situ di un primu invicatuvule manca in a frammentata DNA, solu l'amplificazione lineale si trova. In u casu più favorevule, i frammenti ponu ridisce, ma i cecchi seranu chjuchi è sottu à i livelli di rilevazione.
(b) perdita di basa, principalmente dovuta à a depurinazione è a furmazione di a diminuzione di a diminuzione, porta à una diminuzione di u numeru di H-Bonds è una diminuzione di TM. Durante a fase elunicata amara, I primer si smetteranu falà da a matrice AMR è ùn ne hà micca »annunziu ancu ancu menu di cundizioni di stringenti.
(c) Basi di e tinta adiacenti formanu un tt dimer.
Un altru prublema cumunu chì si trova spessu in diagnostichi moleculari hè a liberazione menu o ottimali di l'acidi nucleichi di destinazione cumparatu cù l'estrazione di u cloroform di filole. In casi estremi, questu pò esse assuciatu cù falsi negativi. Assai tempu pò esse salvatu da a digestione in equitazione di e rubrisi in equitazione, ma stu metudu spessu in a sensibilità di a bassa pc

Inibizione di attività polimerase durante l'amplificazione

In generale, l'inibizione hè adupratu cum'è cuncettu di cuntainer per qualificà tutti i fattori chì portanu à risultati di pcropimamentu imoptimali. In un sensu strettu è una inibizione hè limitata à l'attività di l'enzima, vale à dì, reduce o prevene l'accordamentu di u produttu di a DNA di u situ attivu (esci, Mg2 + per Taq DNA Polymerase)
Cumpunenti in a mostra o diverse buffers chì cuntenenu i reagenti ponu inibisce l'enzima o a trappulazione (per esempiu, inattivà a destra o falza negativa di pcr.
Eppuru, parechje interazzioni trà cumpunenti di reazione è acidi nucleichi di destinazione sò ancu designati cum'è "Pcr Inhibitori". Una volta l'integrità di a cellula hè interrotta da l'isulazione è l'acidu nucleicu hè liberatu, interazzioni trà a mostra è a so soluzione circonda è a so suluzione. Per esempiu, 'i scaventi pò ligà l'ADMA SINGUE o DOWN-Straded per via di l'isulazione è a purificazione riducendu u numeru di destinazione chì eventualmente ghjunghje à u bessel di a reazione pcr.
In i ammibitori di u generale, pcr in a maiò parte di i fluidi è testi diagnostichi cliniche (Urea in urine (Urea in urina () cumpunenti organici, glyparen, grassu, ca2je) è cumpunenti)

L'inhibitori PCR Prevalenti ponu esse truvati in e batterie eukaryotiche, una DNA non-ligata di matrici di l'AGNA è equipamenti di laboratoriu cum'è guanti è plastici. A purificazione di l'acidi nucleichi durante o dopu l'estrazione hè u metudu preferitu per caccià l'inhibitori PCR.
Oghje, diversi equipaghji d'estratti automatizati pò rimpiazzà parechji protokolli manuale, ma 100% ricuperazione è / o purificazione di i destinati ùn sò mai stati rializati. L'inhibitori potenziale ponu ancu esse presenti in l'acidi nucleichi purificati o ponu avè digià effettu. E strategie differenti esistenu per riduce l'impattu di l'inibitori. A scelta di a polimerase adatta pò avè un impattu significativu nantu à l'attività inibitore. Altri metudi pruvati per riduce a inhibizione Pcring sò aderenti di a cuncentrazione di polemerase o applicà l'additivi cum'è BSA.
L'inibizione di e reazzioni PCR pò esse dimustratu da l'usu di u Control di Qualità Interna (IPC).
A cura deve esse presa per caccià tutti i keissaghji è altri suluzioni in u kit d'extrazione, cum'è Ethanol, Edta, Cetab, Licca, GEOPNC, acidu nucileicu isolatu. Sicondu a so cuncentrazione, puderanu attivà o inibisce PC.