Fattori d'interferenza in e reazioni PCR

Durante a reazione PCR, si scontranu spessu certi fattori interferenti.
A causa di l'altissima sensibilità di a PCR, a contaminazione hè cunsiderata cum'è unu di i fattori più impurtanti chì influenzanu i risultati di a PCR è pò pruduce risultati falsi pusitivi.
Altrettantu critiche sò e diverse fonti chì portanu à risultati falsi negativi. Sè una o più parti essenziali di a mistura PCR o a reazione di amplificazione stessa sò inibite o interferite, u test diagnosticu pò esse impeditu. Questu pò purtà à una efficienza ridotta è ancu à risultati falsi negativi.
In più di l'inibizione, a perdita di l'integrità di l'acidu nucleicu di u bersagliu pò accade per via di e cundizioni di spedizione è/o di almacenamentu prima di a preparazione di u campione. In particulare, e temperature elevate o un almacenamentu inadeguatu ponu purtà à danni à e cellule è à l'acidi nucleichi. A fissazione di e cellule è di i tessuti è l'inclusione in paraffina sò cause ben cunnisciute di frammentazione di u DNA è un prublema persistente (vede e Figure 1 è 2). In questi casi, ancu l'isolamentu è a purificazione ottimali ùn saranu micca d'aiutu.

Figura 1 | Effettu di l'immobilizazione nantu à l'integrità di u DNA
L'elettroforesi in gel d'agarosa hà dimustratu chì a qualità di u DNA isolatu da sezioni di paraffina di autopsie variava cunsiderabilmente. U DNA di diverse lunghezze medie di frammenti era presente in l'estratti secondu u metudu di fissazione. U DNA hè statu cunservatu solu quandu hè statu fissatu in campioni congelati nativi è in formalina neutra tamponata. L'usu di un fissativu Bouin fortemente acidicu o di formalina senza tampone chì cuntene acidu formicu hà risultatu in una perdita significativa di DNA. A frazione restante hè assai frammentata.
À manca, a lunghezza di i frammenti hè espressa in coppie di kilobasi (kbp)

Figura 2 | Perdita di integrità di i bersagli di l'acidu nucleicu
(a) Un spaziu 3′-5′ nant'à i dui filamenti pruvucarà una rottura in u DNA bersagliu. A sintesi di u DNA si ferà sempre nant'à u picculu frammentu. Tuttavia, s'ellu manca un situ di annealing di u primer nant'à u frammentu di DNA, si faci solu una amplificazione lineare. In u casu u più favurevule, i frammenti ponu ri-saturassi l'uni à l'altri, ma i rendimenti seranu chjuchi è sottu à i livelli di rilevazione.
(b) A perdita di basi, principalmente per via di a depurinazione è di a furmazione di dimeri di timidina, porta à una diminuzione di u numeru di ligami à idrogenu è à una diminuzione di Tm. Durante a fase di riscaldamentu allungata, i primer si scioglieranu da u DNA di a matrice è ùn si ricotteranu ancu in cundizioni menu stringenti.
(c) E basi di timina adiacenti formanu un dimeru TT.
Un altru prublema cumunu chì si verifica spessu in a diagnostica moleculare hè a liberazione menu ottima di l'acidi nucleichi bersagli paragunata à l'estrazione cù fenolu-cloroformu. In casi estremi, questu pò esse assuciatu à falsi negativi. Si pò risparmià assai tempu cù a lisi bollente o a digestione enzimatica di i detriti cellulari, ma questu metudu spessu porta à una bassa sensibilità PCR per via di una liberazione insufficiente di l'acidi nucleichi.

Inibizione di l'attività di a polimerasi durante l'amplificazione

In generale, l'inibizione hè aduprata cum'è un cuncettu di cuntenitore per discrive tutti i fattori chì portanu à risultati PCR subottimali. In un sensu strettamente biochimicu, l'inibizione hè limitata à l'attività di l'enzima, vale à dì, riduce o impedisce a cunversione substratu-produttu per via di l'interazione cù u situ attivu di a DNA polimerasi o di u so cofattore (per esempiu, Mg2+ per a Taq DNA polimerasi).
I cumpunenti in u campione o diversi buffer è estratti chì cuntenenu reagenti ponu inibisce direttamente l'enzima o intrappulà i so cofattori (per esempiu EDTA), inattivendu cusì a polimerasi è purtendu à risultati PCR diminuiti o falsi negativi.
Tuttavia, parechje interazzione trà i cumpunenti di reazione è l'acidi nucleichi chì cuntenenu u bersagliu sò ancu designati cum'è "inibitori di PCR". Una volta chì l'integrità di a cellula hè disturbata da l'isolamentu è l'acidu nucleicu hè liberatu, ponu accade interazzione trà u campione è a so suluzione circundante è a fase solida. Per esempiu, i "scavengers" ponu ligà u DNA à catena unica o doppia per mezu di interazzione non covalenti è interferisce cù l'isolamentu è a purificazione riducendu u numeru di bersagli chì eventualmente ghjunghjenu à u vasu di reazione PCR.
In generale, l'inibitori di a PCR sò prisenti in a maiò parte di i fluidi corporei è di i reagenti utilizati per i testi diagnostichi clinichi (urea in l'urina, emoglobina è eparina in u sangue), in i supplementi dietetichi (cumponenti organichi, glicogenu, grassi, ioni Ca2+) è in i cumponenti di l'ambiente (fenoli, metalli pesanti).

L'inibitori di PCR più prevalenti si ponu truvà in batteri è cellule eucariote, DNA non bersaglio, macromolecule leganti à u DNA di matrici tissutali è apparecchiature di laburatoriu cum'è guanti è plastiche. A purificazione di l'acidi nucleici durante o dopu l'estrazione hè u metudu preferitu per rimuovere l'inibitori di PCR.
Oghje, diverse apparecchiature d'estrazione automatizate ponu rimpiazzà parechji protokolli manuali, ma ùn hè mai stata ottenuta una recuperazione è/o purificazione di u 100% di i bersagli. L'inibitori potenziali ponu esse sempre presenti in l'acidi nucleici purificati o ponu avè digià fattu effettu. Esistenu diverse strategie per riduce l'impattu di l'inibitori. A scelta di a polimerasi adatta pò avè un impattu significativu nantu à l'attività di l'inibitore. Altri metudi pruvati per riduce l'inibizione di a PCR sò l'aumentu di a concentrazione di polimerasi o l'applicazione di additivi cum'è a BSA.
L'inibizione di e reazioni PCR pò esse dimustrata per mezu di u cuntrollu di qualità di u prucessu internu (IPC).
Ci vole à fà attenzione à caccià tutti i reagenti è altre suluzioni in u kit d'estrazione, cum'è l'etanolu, l'EDTA, u CETAB, LiCl, u GuSCN, l'SDS, l'isopropanolu è u fenolu, da l'isolatu d'acidu nucleicu per mezu di una tappa di lavaggio accurata. Sicondu a so cuncentrazione, ponu attivà o inibisce a PCR.